IDT Alt-R® CRISPR-Cas9基因編輯系統
IDT（Integrated DNA Technologies）作(zuo)為核酸定制合成領域的(de)知名企(qi)業，依托30年來的(de)技術研發，推(tui)出(chu)了(le)Alt-R®系列(lie)CRISPR-Cas9基因(yin)編輯產品，通(tong)過對(dui)gRNA序列(lie)、Cas9核酸酶優化，對(dui)RNP轉(zhuan)染效率(lv)、同(tong)源(yuan)重組修(xiu)復HDR效率(lv)的(de)提(ti)升，形成了(le)從crRNA設計(ji)到CRISPR結果檢(jian)測的(de)一(yi)站式解決(jue)方(fang)案，讓(rang)CRISPR-Cas9系統(tong)更(geng)高效、更(geng)簡單(dan)。
Alt-R® CRISPR-Cas9概述
IDT的Alt-R® CRISPR-Cas9系統，分別對(dui)crRNA、tracrRNA、sgRNA序(xu)列進(jin)行優化縮短、化學修飾，對(dui)化膿性鏈球(qiu)菌(jun)S. pyogene Cas9內切(qie)酶結(jie)構域進(jin)行突變，獲得了(le)高精(jing)確性的單鏈、雙(shuang)鏈剪切(qie)功能，再通(tong)過電穿孔（如(ru)Lonza Nucleofector核(he)轉染系統）轉染RNP，可(ke)進(jin)行精(jing)確地基因編輯(ji)操(cao)作。
傳(chuan)統(tong)構(gou)建CRISPR-Cas9質(zhi)粒的方法，質(zhi)粒大小高(gao)達6-10kb，很難(nan)轉(zhuan)(zhuan)染，而如(ru)使(shi)用原代(dai)細胞等(deng)難(nan)轉(zhuan)(zhuan)染的細胞，轉(zhuan)(zhuan)染效(xiao)率(lv)更(geng)低。且質(zhi)粒不(bu)斷產生CRISPR-Cas9，使(shi)脫靶率(lv)顯著增加。IDT轉(zhuan)(zhuan)染RNP蛋白復合體的方法，通(tong)過優化(hua)CRISPR-Cas9組件，在提升剪切精確性的基礎上，提高(gao)轉(zhuan)(zhuan)染效(xiao)率(lv)、減少細胞毒性、降(jiang)低脫靶，進而提高(gao)了基因(yin)編輯效(xiao)率(lv)。
Alt-R® CRISPR-Cas9實驗流程
【方法一】
1、（使用IDT序列設計工具）設計Alt-R® crRNA，使其間隔區（Spacer）序列與DNA靶序列互補，提交給IDT定制合成crRNA；
2、將Alt-R® crRNA與Alt-R® tracrRNA混合，通過crRNA的重復序列區（Repeats）與tracrRNA堿基配對, 形成向導RNA（guide RNA，簡稱gRNA）；
3、將gRNA與Alt-R® Cas9蛋白混勻，形成核糖核蛋白體（ribonucleoprotein，簡稱RNP)；
4、將RNP通過電轉染等導入細胞或細胞核；
5、通過crRNA的Spacer識別DNA靶序列，通過Cas9蛋白識別PAM序列（前間區序列鄰近基序，protospacer adjacent motif，簡稱PAM），對DNA進行剪切；
6、對DNA斷裂處進行修復
①進行非同源末端連接修復(Non-homologous end-joining，簡稱NHEJ），實現基因敲除（knockout）；
②（使用IDT序列設計工具）設計供體DNA模板，進行同源重組修復（Homology directed repair，簡稱HDR），實現基因敲入（knockoin）、基因敲除、基因沉默等。
【方法二(er)】
1、（用IDT工具）設計sgRNA，使其Spacer與DNA靶序列互補，提交給IDT定制合成sgRNA；
2、將sgRNA與Cas9蛋白混勻，形成RNP；
3、將RNP通過電轉染等導入細胞或細胞核；
4、通過sgRNA的Spacer識別DNA靶序列，通過Cas9蛋白識別PAM序列，對DNA進行剪切；
5、對DNA斷裂處進行修復
①進行非同源末端連接修復，實現基因敲除；
②（用IDT工具）設計供體DNA模板，進行同源重組修復，實現基因敲入、敲除、沉默等。
Alt-R® crRNA序(xu)列設計示意(yi)圖
Alt-R® CRISPR-Cas9產品
1、Alt-R® crRNA：由19-20nt特異性序列(lie)(lie)（定制）和16nt通(tong)用序列(lie)(lie)融(rong)合形成(cheng)，相(xiang)比野生型(xing)，序列(lie)(lie)更短，中靶率更高。經(jing)化學修(xiu)飾防止被細胞(bao)核糖(tang)核酸酶降(jiang)解(jie)，必須與tracrRNA一起使用以形成(cheng)gRNA。
| 類型 |
產品名稱 |
規格 |
包裝 |
| crRNA |
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA |
2 nmol |
管 |
| 10 nmol |
管 |
| 2 nmol |
板 |
| 10 nmol |
板 |
| 50 nmol |
管 |
| 100 nmol |
管 |
2、Alt-R® crRNA XT：相(xiang)比Alt-R® crRNA，經其他化學修飾，用于高核酸酶條件或帶(dai)有Cas9 mRNA的實驗(yan)，可提高基因(yin)編(bian)輯(ji)的穩定(ding)性。必(bi)須與tracrRNA一起(qi)使用。
| 類型 |
產品名稱 |
規格 |
包裝 |
| crRNA XT |
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA XT |
2 nmol |
管 |
| 10 nmol |
管 |
| 2 nmol |
板 |
| 10 nmol |
板 |
3、Alt-R® sgRNA：由crRNA和tracrRNA序列(lie)融合組成的(de)單個RNA，含有19-20nt的(de)特異(yi)性(xing)序列(lie)（定制）和80nt通用(yong)序列(lie)，經(jing)化學修飾，穩定性(xing)更(geng)高，用(yong)于(yu)高核酸酶條件或帶有Cas9 mRNA的(de)實驗。相比體外轉錄(lu)的(de)sgRNA，減少細胞免疫反應，更(geng)小(xiao)細胞毒(du)性(xing)。
| 類型 |
產品名稱 |
規格 |
| sgRNA |
Alt-R® CRISPR-Cas9 sgRNA |
2 nmol |
| 10 nmol |
| 50 nmol |
| 100 nmol |
| Custom Alt-R® CRISPR sgRNA |
定制 |
4、Alt-R® tracrRNA：通(tong)用(yong)67nt序(xu)列，遠(yuan)(yuan)遠(yuan)(yuan)短于野生型(xing)的89nt，縮(suo)短后性(xing)能提高(gao)，經化學修飾，具有核酸酶抗性(xing)。可提供熒光標記，檢測轉染(ran)效(xiao)率。必須與crRNA一起使(shi)用(yong)以(yi)形成(cheng)gRNA。
| 類型 |
產品名稱 |
特點 |
規格 |
貨號 |
| tracrRNA |
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA |
無標記 |
5 nmol |
1072532 |
| 20 nmol |
1072533 |
| 100 nmol |
1072534 |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA, ATTO 550 |
熒光標記 |
5 nmol |
1075927 |
| 20 nmol |
1075928 |
圖.穩定表達Cas9蛋白的HEK-293細胞，轉染Alt-R® crRNA(未標記):tracrRNA(標記)，轉染后48小時，熒光顯微鏡下10倍放大。
5、Alt-R® Cas9核(he)酸酶：S. pyogene來(lai)源Cas9，大腸桿菌表達(da)純化，添(tian)加(jia)核(he)定位序列(lie)（Nuclear localization sequence，NLS）和C端6-His標簽(qian)。Alt-R®; HiFi Cas9高(gao)保真核(he)酸酶，經序列(lie)優化，提(ti)高(gao)中(zhong)靶(ba)率，降低脫(tuo)靶(ba)率。以10μg/μL的溶液提(ti)供。100μg Cas9核(he)酸酶=610pmol。
| 類型 |
產品名稱 |
規格 |
貨號 |
| cas9核酸酶 |
Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease V3 |
100 µg |
1081058 |
| 500 µg |
1081059 |
| Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 |
100 µg |
1081060 |
| 500 µg |
1081061 |
6、Alt-R® Cas9切(qie)口酶(mei)(mei)：S. pyogene來源Cas9，大腸桿菌表達(da)純化，添加(jia)核定位序列NLS和C端(duan)6-His標簽。其中Alt-R® Cas9 D10A切(qie)口酶(mei)(mei)中RuvC-like內切(qie)酶(mei)(mei)結構域功能失(shi)活(huo)，對DNA靶向鏈進行單(dan)鏈切(qie)割。Alt-R® Cas9 H840A切(qie)口酶(mei)(mei)，HNH結構域失(shi)活(huo)，對非靶向鏈單(dan)鏈切(qie)割。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9切(qie)口酶(mei)(mei)=610pmol。
| 類型 |
產品名稱 |
規格 |
貨號 |
| cas9切口酶 |
Alt-R® S.p. Cas9 D10A Nickase V3 |
100 µg |
1081062 |
| 500 ug |
1081063 |
| Alt-R® S.p. Cas9 H840A Nickase V3 |
100 µg |
1081064 |
| 500 ug |
1081065 |
7、Alt-R® dCas9蛋白(bai)：S. pyogene來源Cas9，大腸桿菌表達純化，喪失內切酶功(gong)能(neng)，添加核定位(wei)序(xu)列NLS和C端6-His標簽。dCas9蛋白(bai)可用(yong)于CRISPRi，進(jin)行基因下(xia)調（knockdown）等(deng)，相比RNAi，由于CRISPRi需要在(zai)轉(zhuan)錄起始位(wei)點(dian)附近(jin)才能(neng)發(fa)揮功(gong)能(neng)，其脫靶率遠低于RNAi。Alt-R® dCas9蛋白(bai)，以10μg/μL的溶液提供。100μg dCas9蛋白(bai)=610pmol。
| 類型 |
產品名稱 |
規格 |
貨號 |
| dCas9蛋白 |
Alt-R® S.p. dCas9 Protein V3 |
100 µg |
1081066 |
| 500 µg |
1081067 |
8、Alt-R® Cas9電穿(chuan)孔Enhancer：是Cas9特異性的載體DNA，當(dang)使(shi)用原代細胞或難轉染細胞時，可提(ti)(ti)高Lonza(原Amaxa）Nucleofector核轉染系統等(deng)電穿(chuan)孔設備(bei)對(dui)RNP的轉染效(xiao)率，進而提(ti)(ti)高基因編輯(ji)效(xiao)率。
| 類型 |
產品名稱 |
規格 |
貨號 |
| 電穿孔Enhancer |
Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer |
2 nmol |
1075915 |
| 10 nmol |
1075916 |
9、Alt-R® HDR Enhancer：小(xiao)分子化合物，可提高同源重組修(xiu)復概率。在包括貼壁、懸浮的大(da)量細胞(bao)系中(zhong)均有活(huo)性，可用于Cas9核(he)酸酶、Cas12a（Cpf1）核(he)酸酶。
| 類型 |
產品名稱 |
規格 |
貨號 |
| HDR Enhancer |
Alt-R® HDR Enhancer |
100 µL |
1081072 |
| 500 µL |
1081073 |
10、Alt-R® HDR供(gong)體(ti)寡核(he)苷酸：專門為同源重組修復基因敲入(ru)開發，具有比標準(zhun)寡核(he)苷酸更高的穩定性和(he)更高的摻入(ru)率(lv)，可同時(shi)用于(yu)Cas9核(he)酸酶和(he)Cas9切口酶。
Alt-R® CRISPR-Cas9優勢
1、特別優化的crRNA/tracrRNA/sgRNA長度，提高基因編輯性能
以HPRT基(ji)因中的(de)12個位點為靶點，分(fen)別使(shi)用Alt-R® crRNA:tracrRNA、Alt-R® crRNA XT:tracrRNA、Alt-R® sgRNA，與(yu)Alt-R® Cas9核酸(suan)酶組裝成3種RNP，加入2μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer，轉染(ran)HEK-293細胞，培養48小(xiao)時(shi)后，通過二代測序檢測總(zong)的(de)基(ji)因編輯(ji)效(xiao)率，結果(guo)顯示其具有很好的(de)穩定性。
2、化學修飾RNA，增加核酸酶抗性，減少免疫應答和細胞毒性
以HPRT1的12個位點為靶點，分別用Alt-R® crRNA:tracrRNA、體外轉錄（IVT）RNA，轉染可高效表達化膿性鏈球菌Cas9蛋白的HEK-293細胞，24小時后，測定常見應激反應基因IFIT1（A）和OAS2（B）的表達水平。（A）qPCR顯示IVT RNA強烈誘導IFIT1，而Alt-R® RNA無影響。（B）qPCR顯示IVT RNA對OAS2的誘導可測，而Alt-R® RNA處于基線。同時IFITM1、RIGI、OAS1等3個應激反應相關基因均得到相似結果，說明Alt-R® RNA不會激活細胞先天免疫反應。
3、優化(hua)的(de)Cas9蛋白和高(gao)保(bao)真(zhen)HiFi Cas9蛋白，提供更(geng)高(gao)的(de)特異(yi)性切割
4、電穿孔Enhancer，提高轉染效率，尤其是原代細胞等較難轉染的細胞
用0.125μM-4μM RNP（Alt-R® crRNA:tracrRNA:Cas9復合體），通過Lonza Nucleofector 核轉染K562細胞（A）、Jurkat細胞（B）、HEK-293細胞（C）時，使用電穿孔Enhancer（深藍色）、不使用（淺藍色）的實驗效率。
5、HDR Enhancer，提高同源重組修復效率
①提高多種細胞HDR
以人HPRT為靶點，使用Lonza Nucleofector核轉染系統，將4μM RNP（由Alt-R® crRNA、Alt-R® tracrRNA、Alt-R® Cas9組裝），加入4μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer，以3μM IDT Ultramer寡核苷酸作為同源重組修復DNA模板，轉染人多種細胞系。電轉后，細胞培養在含30μM Alt-R® HDR Enhancer的培養基中（綠色），或培養在含有DMSO的培養基中作為陰性對照（棕色），HEK-293、HeLa培養48小時，Jurkat、K562培養72小時，通過限制性片段長度多態性（RFLP）、靶序列PCR進行HDR分析，顯示Alt-R® HDR Enhancer可提高多種細胞類型的同源重組修復效率。
②提高多種基因HDR
以人基因組多個位點為靶點，將4μM Alt-R® Cas9 RNP，加入4μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer、3μM IDT Ultramer單鏈DNA模板，通過電穿孔轉染。電轉后，細胞分別培養在含30μM Alt-R® HDR Enhancer的培養基（藍色）、含有DMSO的培養基（綠色）、未處理的培養基（棕色），48-72小時后，通過RFLP、PCR進行HDR分析，顯示Alt-R® HDR Enhancer可提高不同基因的HDR效率。
6、在線CRISPR序列設計(ji)工具，方便(bian)地設計(ji)高質量的crRNA/sgRNA/同(tong)源重組修復(fu)DNA模板/引(yin)物等
如(ru)物種的基因組富含A、T，或Alt-R® CRISPR-Cas9的位點不適合，IDT同時提供CRISPR-Cas12a系統，盡可(ke)能滿足(zu)基因編輯需求。
Cas9和Cas12a系統區別和應用
| IDT Alt-R® CRISPR |
Alt-R® CRISPR-Cas9系統 |
Alt-R® CRISPR-Cas12a（Cpf1）系統 |
| Alt-R® Cas9核酸酶 |
Alt-R® HiFi Cas9高保真核酸酶 |
Alt-R® Cas9 D10A切口酶 |
Alt-R® Cas9 H840A切口酶 |
Alt-R® dCas9蛋白 |
Alt-R® Cas12a核酸酶 |
| 特點 |
通用Cas9酶，易于使用且經濟實惠 |
經序列優化的Cas9酶，提高中靶率，降低脫靶率，高性價比 |
突變的Cas9酶，在RuvC-like結構域中發生突變，使其缺失在非靶向鏈的切割能力 |
突變的Cas9酶，在HNH結構域中發生突變，使其缺失在靶向鏈的切割能力 |
突變的Cas9酶，僅結合靶向DNA，缺失核酸酶切割能力 |
通用Cas12a酶，富含AT的物種，或使用CRISPR-Cas9有限制 |
| PAM識別 |
NGG |
TTTV或TTTN |
| DNA切割 |
雙鏈 |
雙鏈 |
靶向鏈 |
非靶向鏈 |
\ |
雙鏈 |
| 末端 |
平末端 |
5’突出 |
3’突出 |
\ |
5’突出 |
| 建議用途 |
一般基因編輯實驗 |
滿足大多數CRISPR基因編輯需求，兼顧效率和成本 |
適用于同時使用2種crRNA，各自識別并切割2條鏈中一條，通過將spacer由20nt提高到40nt，實現更高特異性 |
基因沉默，CRISPR干擾CRISPRi |
無法使用Cas9的基因編輯實驗 |
| 規格 |
100 μg或500 μg |
| Cas9+gRNA |
crRNA |
19-20nt特異性序列（推薦使用20nt），16nt通用序列 |
\ |
| tracrRNA |
67nt通用序列 |
\ |
| Cas9+sgRNA |
sgRNA |
19-20nt特異性序列（推薦使用20nt），80nt通用序列，經過序列修飾，不會引起細胞免疫反應，不會激活無關的基因 |
\ |
| Cas12a+crRNA |
crRNA |
\ |
20-24nt特異性序列（推薦使用21nt），20nt通用序列 |
注：
N=任意堿基
V=A、C、G
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——IDT中國一級代理(li)商，北京澤平