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IDT腫瘤突變負荷TMB解決方案
——NGS二代測序基因檢測


北京澤(ze)平代理的美(mei)國進(jin)口IDT NGS二代測(ce)序(xu)產(chan)品，通過文庫構(gou)建試劑(ji)盒、基(ji)因檢測(ce)Panel、定制化(hua)雜交捕獲(huo)探針組等高品質(zhi)試劑(ji)，助力(li)腫(zhong)瘤(liu)突變負(fu)荷(he)（TMB）實驗(yan)室基(ji)礎研究(jiu)。


一、背景介紹

腫(zhong)瘤突變負(fu)荷(he)（tumor mutational burden, TMB）一般指特定基(ji)因(yin)組區域內每(mei)兆堿基(ji)對（Mb）體細胞非同義突變的個(ge)數，可(ke)以間接(jie)反映腫(zhong)瘤產生新(xin)抗原的能(neng)力(li)和(he)程(cheng)度(du)，已被證(zheng)實可(ke)預測多種腫(zhong)瘤的免(mian)疫治療效果(guo)。近年來，越(yue)(yue)(yue)(yue)來越(yue)(yue)(yue)(yue)多的數據證(zheng)實腫(zhong)瘤突變負(fu)荷(he)TMB越(yue)(yue)(yue)(yue)高(gao)的腫(zhong)瘤，新(xin)抗原負(fu)荷(he)越(yue)(yue)(yue)(yue)高(gao)，更有(you)可(ke)能(neng)從(cong)免(mian)疫檢查點(dian)抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICls）治療中獲(huo)益。

目前(qian)檢測(ce)腫(zhong)(zhong)瘤突(tu)變(bian)負(fu)荷(he)TMB的(de)(de)(de)方法主要為(wei)基于二代測(ce)序技術（NGS）的(de)(de)(de)全(quan)外顯子組(zu)(zu)測(ce)序（WES）和定制靶向(xiang)Panel測(ce)序。WES可檢測(ce)整個外顯子中的(de)(de)(de)體細胞突(tu)變(bian)，提供腫(zhong)(zhong)瘤突(tu)變(bian)的(de)(de)(de)圖(tu)譜，因(yin)此，WES也被(bei)認為(wei)是腫(zhong)(zhong)瘤突(tu)變(bian)負(fu)荷(he)TMB檢測(ce)的(de)(de)(de)"金標準”。同時，采用靶向(xiang)Panel進(jin)行腫(zhong)(zhong)瘤基因(yin)組(zu)(zu)學分析已成為(wei)腫(zhong)(zhong)瘤突(tu)變(bian)負(fu)荷(he)TMB檢測(ce)的(de)(de)(de)另一(yi)種重(zhong)要手段。研究人員可以根據前(qian)沿進(jin)展及臨床需求，開發針對腫(zhong)(zhong)瘤基因(yin)的(de)(de)(de)產品，結合生物信(xin)息學算法快(kuai)速高效(xiao)地(di)檢測(ce)腫(zhong)(zhong)瘤靶基因(yin)組(zu)(zu)改變(bian)。



 

 
二、IDT NGS二代測序解決方案

1、IDT xGen cfDNA & FFPE DNA 文庫制備試劑盒——建立高質量文庫

IDT xGen cfDNA & FFPE DNA 文庫(ku)制(zhi)備試劑盒(he)，能夠對微(wei)量(liang)DNA樣本(ben)進行靈敏且(qie)準確的(de)(de)變異檢測。通過(guo)(guo)兩步連接(jie)法(fa)，可獲(huo)得理想的(de)(de)文庫(ku)轉化率(lv)，同(tong)時抑制(zhi)接(jie)頭二聚體(ti)的(de)(de)形(xing)成。在單鏈連接(jie)的(de)(de)過(guo)(guo)程(cheng)中可引入(ru)特異性的(de)(de)分子(zi)標簽（UMI）序列，以適(shi)配(pei)多種去重和錯(cuo)誤校正的(de)(de)方法(fa)。用低質(zhi)量(liang)樣本(ben)建立高質(zhi)量(liang)文庫(ku)，助力TMB腫瘤突變負荷檢測。

IDT文庫制備試劑盒優勢

①為困難(nan)樣本量身打造，更大化數據輸出(chu)；

②提升(sheng)樣本轉(zhuan)化率(lv)，達到更(geng)高的文庫(ku)復雜度；

③結合UMI糾錯處理，實現低頻突變的檢測。
 


圖. IDT xGen cfDNA & FFPE DNA 文庫制備(bei)試(shi)劑(ji)盒可從不(bu)同質量的FFPE樣本中(zhong)獲得更高(gao)的文庫產量和文庫復雜(za)度。使(shi)用(yong)25ng不(bu)同質量的FFPE標(biao)準品(pin)按照IDT提供的標(biao)準流程進(jin)行文庫制備(bei)，并用(yong)61kb的定制Panel進(jin)行捕獲。

 


2、IDT xGen Exome Hyb Panel v2 全外顯子雜交捕獲探針組——高覆蓋度全外顯子組測序WES

IDT xGen Exome Hyb Panel v2 全外顯子(zi)組(zu)雜交捕(bu)(bu)(bu)獲(huo)探(tan)(tan)針(zhen)組(zu)，由415,115條(tiao)單獨合成(cheng)且(qie)經過質檢的(de)IDT xGen Custom Hyb Panel - Production 捕(bu)(bu)(bu)獲(huo)探(tan)(tan)針(zhen)組(zu)成(cheng)。全外顯子(zi)探(tan)(tan)針(zhen)組(zu)跨越(yue)人類基因組(zu)的(de)34Mb目標(biao)區域（19,433個基因），并且(qie)覆(fu)蓋(gai)39Mb的(de)探(tan)(tan)針(zhen)空間（即由探(tan)(tan)針(zhen)覆(fu)蓋(gai)的(de)基因組(zu)區域)）。IDT全外顯子(zi)探(tan)(tan)針(zhen)使用新型“捕(bu)(bu)(bu)獲(huo)感知（capture-aware）”算法進行設(she)計，并進行了(le)特殊的(de)脫靶分析，以實現更完整的(de)設(she)計覆(fu)蓋(gai)度(du)。IDT全外顯子(zi)探(tan)(tan)針(zhen)組(zu)中(zhong)的(de)所有探(tan)(tan)針(zhen)均嚴格按照ISO13485標(biao)準進行生產(chan)，每(mei)條(tiao)探(tan)(tan)針(zhen)均經過質譜法和雙定(ding)量檢驗，保(bao)證(zheng)探(tan)(tan)針(zhen)的(de)質量及在探(tan)(tan)針(zhen)庫(ku)中(zhong)的(de)濃度(du)，是穩(wen)定(ding)可靠的(de)高覆(fu)蓋(gai)度(du)WES捕(bu)(bu)(bu)獲(huo)工具(ju)。



圖(tu). IDT外顯子(zi)探針一致的批次穩定(ding)性，減少(shao)昂貴的重新驗證。使用100ngDNA建庫，并對8個樣(yang)本進(jin)行混合捕獲（8混)）。兩(liang)名操作人員分別在不(bu)同日期和(he)不(bu)同地點進(jin)行捕獲。IDT埃(ai)德特的xGen Exome Hyb Panel v2 外顯子(zi)測(ce)序探針組(zu)的線(xian)性回歸線(xian)與預測(ce)的“完全”相關線(xian)高度(du)接近，其中R2值為0.76。

圖(tu). IDT xGen Exome Hyb Panel v2 全(quan)外(wai)(wai)顯子(zi)(zi)探針組在捕(bu)獲(huo)效(xiao)率方面(mian)表現出色(se)。根據IDT外(wai)(wai)顯子(zi)(zi)組探針捕(bu)獲(huo)實驗(yan)方案，對文庫進(jin)行捕(bu)獲(huo)和多重富(fu)集，獲(huo)得單(dan)樣(yang)本和12混（分別為IDT-1和IDT-12）捕(bu)獲(huo)的實驗(yan)結果。以Illumina NextSeq 測序儀高通量模(mo)式對2×100雙端(duan)reads進(jin)行測序。用Picard按(an)每個文庫5Gb確定中靶堿(jian)基（選定堿(jian)基百(bai)分比)。

 

 
3、IDT xGen Custom Hyb Panels - Production 探針庫——高性能捕獲探針

除WES測序(xu)(xu)(xu)外, TMB腫瘤突變負荷(he)還可(ke)以通(tong)(tong)過(guo)定制(zhi)化測序(xu)(xu)(xu)Panel進行(xing)檢(jian)測，這些Panel需要使用(yong)質量(liang)可(ke)靠的(de)捕獲探(tan)(tan)針(zhen)組。IDT xGen Custom Hyb Panels - Production 捕獲探(tan)(tan)針(zhen)庫是帶有(you)5'端生(sheng)物素標(biao)記的(de)DNA探(tan)(tan)針(zhen)，每一(yi)條探(tan)(tan)針(zhen)均經過(guo)單(dan)獨(du)(du)合成(cheng)、單(dan)獨(du)(du)質檢(jian)，可(ke)用(yong)于二代測序(xu)(xu)(xu)實驗中目(mu)標(biao)DNA序(xu)(xu)(xu)列富(fu)集。實驗證明，與(yu)市場上其他通(tong)(tong)過(guo)微陣列合成(cheng)的(de)捕獲探(tan)(tan)針(zhen)相比(bi)，IDT xGen Custom Hyb Panels - Production 捕獲探(tan)(tan)針(zhen)的(de)捕獲均一(yi)性更高，GC偏好性更小(xiao)，能以更少的(de)數據(ju)投入獲得更佳的(de)測序(xu)(xu)(xu)深度。IDT xGen Custom Hyb Panels 探(tan)(tan)針(zhen)庫采(cai)用(yong)模(mo)塊化合成(cheng)制(zhi)備和使用(yong)，既可(ke)以獨(du)(du)立使用(yong)，也可(ke)以用(yong)spike-in panel 的(de)形式與(yu)現(xian)有(you)的(de)探(tan)(tan)針(zhen)庫結合使用(yong)，具(ju)有(you)非常(chang)高的(de)靈活性。

IDT Custom Hyb Panels - Production 探針庫優勢

①單獨合成、單獨質控的探針，實現高效、均一的目(mu)標(biao)序列(lie)富(fu)集；

②模塊化(hua)設計，實現經濟(ji)、高(gao)效的定制和簡單(dan)輕松(song)的目標序列擴充(chong)；

③嚴格質控降低批次(ci)間差異。
 


圖.使用(yong)IDT的探(tan)針(zhen)庫實(shi)現(xian)高(gao)度(du)均一(yi)的目標(biao)(biao)區域覆蓋。針(zhen)對(dui)標(biao)(biao)準(zhun)品基因組DNA（Coriell）構建文(wen)庫，使用(yong)IDT xGen Custom Hyb Panels -Production 探(tan)針(zhen)庫進(jin)行(xing)捕獲反應（目標(biao)(biao)區域為88kb）。采用(yong)Illumina NextSeq 測序儀進(jin)行(xing)測序，并對(dui)600K reads進(jin)行(xing)生信(xin)分析。結果顯示(shi)，（A）單(dan)次(ci)(ci)測序的覆蓋均一(yi)度(du)較(jiao)高(gao)；（B）同(tong)(tong)一(yi)個(ge)探(tan)針(zhen)庫的兩個(ge)不同(tong)(tong)批次(ci)(ci)，顯示(shi)出較(jiao)高(gao)的一(yi)致性(xing)。

 
 

三、IDT腫瘤突變負荷TMB成功案例



中國醫(yi)學科學院腫瘤醫(yi)院團隊(dui)基于NGS Panel 檢(jian)(jian)測血液腫瘤突變(bian)負荷（bTMB），驗證了bTMB作為非(fei)小細胞肺癌(ai)患者(zhe)免疫治療(liao)的(de)(de)(de)(de)生物標志物的(de)(de)(de)(de)可行性。該研(yan)究(jiu)使(shi)用(yong)了IDT的(de)(de)(de)(de)定制化Panel和(he)IDT xGen Exome Hyb Panel 進(jin)行檢(jian)(jian)測。研(yan)究(jiu)納入48例晚期非(fei)小細胞肺癌(ai)外(wai)周血及(ji)腫瘤組織配對標本(ben)。NCC-GP150計(ji)(ji)算(suan)的(de)(de)(de)(de)bTMB與WES計(ji)(ji)算(suan)的(de)(de)(de)(de)TMB間的(de)(de)(de)(de)Spearman相關系數達(da)到(dao)0.62；當bTMB≥6時(shi)，約登指數達(da)到(dao)最佳（0.59，敏感性88%，特異性71%）。

參考文獻

Zhijie Wang. Jianchun Duan, Shangli et al. Assessment of blood tumor mutational burden as a potential biomarker for immunotherapy in patients with non-small cell lung cancer with use of a next-generation sequencing cancer gene panel. JAMA Oncol. 2019;5(5):696-702.

  


四、IDT腫瘤突變負荷相關產品

 


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