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IDT NGS二代測序微衛星不穩定性MSI解決方案
——文庫構建試劑盒、定制化Panel雜交捕獲探針組


北京澤平代理(li)的(de)IDT NGS二(er)代測序(xu)產品，通過(guo)高質量文庫構建試劑盒(he)、穩定的(de)定制(zhi)化(hua)(hua)Panel雜交捕獲探針(zhen)組、對(dui)手(shou)動(dong)或自動(dong)化(hua)(hua)工(gong)(gong)作站的(de)高通量處(chu)理(li)支持，成(cheng)為(wei)微(wei)衛星不穩定性（MSI）實(shi)驗室基礎研究(jiu)的(de)高效工(gong)(gong)具。

 
一、背景介紹

微衛(wei)(wei)星(xing)不(bu)(bu)(bu)穩(wen)(wen)定(ding)性(xing)（Microsatellite Instability，MSI）是(shi)(shi)指在DNA復制(zhi)(zhi)時(shi)由于重復單(dan)位的(de)(de)(de)(de)插入或(huo)缺失(shi)引起(qi)的(de)(de)(de)(de)微衛(wei)(wei)星(xing)（Microsatellite, MS）序列長度改變的(de)(de)(de)(de)現(xian)象(xiang)，常由錯配修(xiu)復功能(neng)（Mismatch repair，MMR）缺陷引起(qi)。微衛(wei)(wei)星(xing)不(bu)(bu)(bu)穩(wen)(wen)定(ding)性(xing)MSI現(xian)象(xiang)于1993年在結直腸癌中首次發現(xian)。根據MSI被檢測出的(de)(de)(de)(de)頻率可(ke)以(yi)分為三類：微衛(wei)(wei)星(xing)高度不(bu)(bu)(bu)穩(wen)(wen)定(ding)性(xing)（MSI-H）、微衛(wei)(wei)星(xing)低度不(bu)(bu)(bu)穩(wen)(wen)定(ding)性(xing)（MSIHL）、微衛(wei)(wei)星(xing)穩(wen)(wen)定(ding)（MS-S）。隨著診(zhen)療水平的(de)(de)(de)(de)進(jin)步和靶向藥物(wu)、免疫(yi)治(zhi)療的(de)(de)(de)(de)出現(xian)，免疫(yi)檢查點抑制(zhi)(zhi)劑(ji)應(ying)用的(de)(de)(de)(de)越來越廣泛(fan)。MSI微衛(wei)(wei)星(xing)不(bu)(bu)(bu)穩(wen)(wen)定(ding)性(xing)是(shi)(shi)一(yi)種預測患者對免疫(yi)檢查點抑制(zhi)(zhi)劑(ji)反應(ying)的(de)(de)(de)(de)重要生(sheng)物(wu)標志物(wu)，同(tong)時(shi)也是(shi)(shi)一(yi)個泛(fan)癌種生(sheng)物(wu)標志物(wu)，在腫瘤的(de)(de)(de)(de)診(zhen)斷和治(zhi)療中扮演(yan)著重要角色。

隨著高通量測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)平臺的(de)廣(guang)泛使用和二代測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)NGS成本的(de)降低，NGS平臺目標(biao)區域測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)（NGS Panel）或(huo)WES全外顯子組(zu)(zu)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)逐漸也(ye)應用于微衛星(xing)不穩(wen)定性MSI的(de)檢(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)中。NGS檢(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)通量大、靈敏度(du)及特異性高，采用NGS Panel 一次性可以(yi)檢(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)上千個MSI位點、錯配(pei)修復(fu)功能MMR基(ji)因(yin)狀態及其(qi)他(ta)分子標(biao)志物(wu)。同(tong)時，基(ji)于外周血循環腫瘤DNA（ctDNA）的(de)MSI微衛星(xing)不穩(wen)定性的(de)檢(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)，也(ye)為腫瘤組(zu)(zu)織取樣困難或(huo)不足的(de)晚期實體瘤患者MSI檢(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)提(ti)供了新(xin)選(xuan)擇(ze)。

 

 
二、IDT NGS二代測序解決方案



 
1、IDT xGen cfDNA & FFPE DNA 文庫制備試劑盒

IDT xGen cfDNA & FFPE DNA文庫(ku)制備(bei)試劑(ji)盒，支持對(dui)微(wei)量DNA樣(yang)本(ben)(ben)進行靈敏且準確的變異檢測。通(tong)過(guo)兩步連(lian)接法，可在(zai)獲(huo)得(de)理想文庫(ku)轉化率的同時，抑制接頭二(er)聚體的形成。在(zai)單鏈(lian)連(lian)接的過(guo)程中，可引入特異性(xing)的分子標簽（UMI）序列(lie)，以適(shi)配多種去(qu)重和錯(cuo)誤校正的方(fang)法。實現用低品(pin)質(zhi)樣(yang)本(ben)(ben)建立高品(pin)質(zhi)文庫(ku)，助力微(wei)衛星不(bu)穩定(ding)MSI檢測。



 
優勢

①提升(sheng)樣本(ben)轉化(hua)率，達(da)到更高(gao)的文(wen)庫復雜(za)度；

②結(jie)合UMI糾錯處(chu)理(li)，實現低(di)頻突變的檢(jian)測；

③為困難樣(yang)本(ben)量(liang)身(shen)打造，更大化數(shu)據輸(shu)出。




圖. IDT xGen cfDNA & FFPE DNA文庫制備試劑盒提供了非常高的轉化率和文庫復雜度，從而在目標區域獲得更好的覆蓋深度。使用10ng的cfDNA標準品并按照IDT提供的標準流程進行文庫制備，并用覆蓋16kb的定制IDT xGen Custom Hyb Panels- Production 探針對文庫進行靶向捕獲。將捕獲后的文庫混合起來并在Illumina Nextseq 550 測序儀上進行測序。采用BWA（0.7.15）對測序數據進行比對，并用Picard（2.18.9）進行覆蓋深度和復雜度（評估單一分子數，使用參數為HS文庫大小）的計算。

 


圖. IDT xGen cfDNA & FFPE DNA文庫制備試劑盒提高對低頻突變的檢測靈敏度和特異性。使用25ng的cfDNA標準品按照IDT提供的標準流程進行文庫制備，標準品中突變基因的頻率（MAF）為0.25%。使用61kb的定制IDT xGen Custom Hyb Panels - Production 探針進行文庫捕獲，在測序后使用BWA（0.7.15）進行比對并按照IDT xGen cfDNA & FFPE試劑盒分析指南所述進行start-stop去重，或者按照combined read families的方法進行去重和錯誤校正。最后使用VarDict（1.5.8）識別變異。PPV=陽性預測值，是衡量突變檢出準確度的指標。
 
 


2、IDT xGen Custom Hyb Panels - Production 探針庫

IDT xGen Custom HybPanels - Production 探針是帶有5′端生物素標記的DNA探針，每一條探針均經過單獨合成、單獨質檢，可用于NGS二代測序中對目標序列進行富集。實驗證明，與通過微陣列合成的捕獲探針相比，IDT xGen Custom Hyb Panels -Production 探針實現的捕獲均一性更高，GC偏好性更少，能夠以更少的測序次數獲得更佳的測序深度。IDT xGen Custom Hyb Panels - Production 探針庫可用模塊化的方式進行制備和使用，既可以獨立使用，也可以通過spike-in panel的形式與現有的探針庫結合使用，具有非常高的靈活性，是品質穩定、性能優異的捕獲探針選擇。


優勢
 
①單獨合成、單獨質控的探針，實現高效均一的目標富集；

②模塊化設計，實現經濟高效的定制和簡單輕松的目標靶點擴充；

③嚴格質控，降低批次間差異。



圖3.使用IDT的探針庫實現高度均一的目標區域覆蓋。針對標準品基因組DNA（Coriell）構建文庫，使用IDT xGen Custom Hyo Panels -Production 探針庫進行捕獲反應（目標區域為88kb）。富集后的文庫在Illumina Nextseq測序儀進行測序，并對600K reads進行生信分析。結果顯示，（A）單次測序的覆蓋均一度較高；（B）同一個探針庫的兩個不同批次，顯示出較高的一致性。


 

三、成功案例

研究(jiu)人(ren)員使用了(le)IDT xGen Exome Hyb Panel 2 以(yi)及定制化的IDT xGen Custom Hyb Panels-Production 探針庫（包含150個癌(ai)癥(zheng)相關(guan)基因），進行了(le)基于血漿樣(yang)本的微衛星不(bu)穩(wen)定MSI檢(jian)測(ce)的技術驗(yan)證(zheng)和臨床(chuang)驗(yan)證(zheng)。這是國內(nei)通(tong)過臨床(chuang)療(liao)效(xiao)驗(yan)證(zheng)的bMSI檢(jian)測(ce)，該研究(jiu)同(tong)時也對中(zhong)國18個癌(ai)種5000+例真實大樣(yang)本進行了(le)MSI微衛星不(bu)穩(wen)定的檢(jian)測(ce)以(yi)及數據的總結。

該(gai)研(yan)究(jiu)對(dui)經PCR-MSI檢(jian)測確(que)(que)認(ren)的40例(li)tMSI-H和209例(li)tMSS晚期(qi)胃(wei)腸(chang)腫瘤(liu)患(huan)者(zhe)(zhe)的外周血進(jin)行技術驗(yan)證(zheng)。該(gai)bMSI算法篩出33例(li)tMSI-H患(huan)者(zhe)(zhe)和201例(li)tMSS患(huan)者(zhe)(zhe)，與“金標(biao)準”組織PCR對(dui)照(zhao)準確(que)(que)性達到94%（靈敏度：82.5%，特異性：96.2%）。



表(biao). 通(tong)過二代測序的方法(fa)檢(jian)測血液微衛星不穩定(ding)性（bMSI）與組織PCR檢(jian)測MSI（tMSl）時結果的一致性。


參考文獻

1. Wang Z, Zhao X, Gao C, et al. Plasma-based microsatellite instability detection strategy to guide immune checkpoint blockade treatment[J]. Journal for lmmunotherapy of Cancer, 2020, 8(2):e001297.

2. Wang Z, Duan J, Cai S, et al. Assessment of blood tumor mutational burden as a potential biomarker for immunotherapy in patients with non-small cell lung cancer with use of a next-generation sequencing cancer gene panel. JAMA Oncol 2019;5:696-702.
 

IDT為NGS靶向捕獲實驗提供端到端的產品覆蓋，并在精準性、經濟性和穩定性這三個方面具有顯著優勢。

①精確性：IDT埃豐富的UMI接頭選擇，結合以IDT xGen cfDNA & FFPE DNA文庫制備試劑盒為代表的新穎的建庫方法，可大大提高樣本轉化率和檢測靈敏度；高質量的探針合成為高效檢測體細胞突變和甲基化水平打下了堅實的基礎，助力ctDNA的多維度研究。

②經濟性：IDT xGen Custom Hyb Panels - Accel 探針庫進一步降低使用門檻，加快探針交付速度，讓新項目快人一步。

③穩定性：超過30年的寡核苷酸合成經驗，結合獨特的化學合成工藝和嚴格的質控方法，使IDT xGen Custom Hyb Panels - Production 探針組的表現穩定。

 

 
四、IDT微衛星不穩定性MSI相關產品

 

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