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IDT NGS二代測序微小殘留病灶MRD解決方案
——文庫構建試劑盒、定制化Panel雜交捕獲探針組

 
北京澤平代(dai)理的IDT NGS二代(dai)測序(xu)DNA建庫試劑盒、定制(zhi)化Panel雜交捕(bu)獲探針組，為高效進行微小(xiao)殘(can)留病灶（MRD）實驗室基礎研究提供了理想(xiang)選(xuan)擇(ze)。

 
一、背景介紹

微(wei)小(xiao)殘留(liu)病灶(zao)（minimal residual disease, MRD）或(huo)分(fen)子(zi)(zi)殘留(liu)病灶(zao)（molecular residual disease），是指癌(ai)(ai)癥患者(zhe)經過手術根治性治療后，傳統影像(xiang)學或(huo)實驗室(shi)方法不能發(fa)現病灶(zao)，但通過基于二代(dai)測序(xu)（NGS）的(de)液體(ti)活檢(jian)技術可(ke)檢(jian)出癌(ai)(ai)細胞(bao)分(fen)子(zi)(zi)的(de)情況。實體(ti)瘤患者(zhe)檢(jian)出微(wei)小(xiao)殘留(liu)病灶(zao)MRD代(dai)表癌(ai)(ai)細胞(bao)在體(ti)內持續存(cun)在，癌(ai)(ai)癥復發(fa)風險高。微(wei)小(xiao)殘留(liu)病灶(zao)MRD在多種實體(ti)瘤中都具有(you)很好的(de)預(yu)后價(jia)值。

2021年初(chu)，結腸癌NCCN 2021.V2版指南(nan)(nan)出爐，在(zai)討論(lun)部(bu)分中新增了(le)對外周血循環(huan)腫瘤(liu)DNA（ctDNA）檢(jian)測的描述。指南(nan)(nan)引用了(le)三項臨(lin)床研(yan)究，其均采用了(le)結合腫瘤(liu)組織測序的ctDNA檢(jian)測方案(an)，論(lun)證了(le)ctDNA指導(dao)的微小殘留病灶MRD方法提示結腸癌患者接受治療后(hou)復發可能的可行性(xing)。

目前實(shi)體(ti)(ti)瘤領域通(tong)過ctDNA檢測(ce)微(wei)小(xiao)殘留(liu)病(bing)(bing)灶MRD的方法主要(yao)有兩類，分別是基(ji)于血漿檢測(ce)的tumor-agnostic方案（使用(yong)固定panel進(jin)行(xing)多位(wei)點覆蓋(gai)的ctDNA檢測(ce)）和(he)基(ji)于組織(zhi)先驗的tumor-informed方案（先對(dui)組織(zhi)進(jin)行(xing)WES全(quan)外(wai)顯子測(ce)序以獲得信息(xi)，再個(ge)性(xing)化定制panel進(jin)行(xing)ctDNA超深(shen)度(du)測(ce)序）。不(bu)同實(shi)體(ti)(ti)瘤的個(ge)體(ti)(ti)化差異巨大(da)， panel的設(she)計需要(yao)深(shen)思熟慮；早期實(shi)體(ti)(ti)瘤釋放到(dao)外(wai)周血中的ctDNA量非(fei)(fei)常(chang)少，對(dui)檢測(ce)靈(ling)敏度(du)要(yao)求非(fei)(fei)常(chang)高；ctDNA檢測(ce)作為病(bing)(bing)程管理的一(yi)部分，檢測(ce)的可重(zhong)(zhong)復性(xing)同樣至關重(zhong)(zhong)要(yao)；這些因素對(dui)微(wei)小(xiao)殘留(liu)病(bing)(bing)灶MRD檢測(ce)在實(shi)體(ti)(ti)瘤中的應用(yong)帶(dai)來了巨大(da)的挑(tiao)戰。
 

 

二、IDT NGS二代測序解決方案

IDT可以(yi)提供(gong)豐富的產品組合，滿足從游離(li)DNA樣本文(wen)庫構建(jian)到(dao)靶向捕獲的全套需求。




1、IDT xGen cfDNA & FFPE DNA文庫制備試劑盒

IDT xGen cfDNA & FFPE DNA文(wen)庫制備試劑盒，支持對微(wei)量(liang)DNA樣本進行靈敏且準確的(de)(de)變異檢(jian)測。通過(guo)兩(liang)步(bu)連接(jie)法(fa)，可在獲得理想文(wen)庫轉化率(lv)的(de)(de)同時，抑制接(jie)頭二聚體的(de)(de)形成。在單(dan)鏈連接(jie)的(de)(de)過(guo)程(cheng)中，可引入特異性的(de)(de)分子標簽（UMI）序列，以(yi)適配多種去(qu)重(zhong)和錯誤校正的(de)(de)方法(fa)。實現用低(di)品質樣本建立高品質文(wen)庫，助力微(wei)小殘(can)留病灶MRD研究。
 


 
優勢
 
①為(wei)困難樣本(ben)量身打造(zao)，更大化數據輸出；

②提(ti)升樣本轉化率(lv)，達到更高的文庫復雜度；

③結合UMI糾錯處理，實現低頻突變的檢測。

 


圖. IDT xGen cfDNA & FFPE DNA文(wen)(wen)庫(ku)制備(bei)試劑盒提供了非常(chang)高的(de)(de)(de)轉化率和文(wen)(wen)庫(ku)復雜度(du)，從而(er)在目標區(qu)域獲(huo)得更好(hao)的(de)(de)(de)覆蓋(gai)深(shen)度(du)。使用10ng的(de)(de)(de)cfDNA標準品并按照IDT提供的(de)(de)(de)標準流程進行(xing)(xing)文(wen)(wen)庫(ku)制備(bei)，并用覆蓋(gai)16kb的(de)(de)(de)定制IDT xGen Custom Hyb Panels- Production 探針(zhen)對(dui)文(wen)(wen)庫(ku)進行(xing)(xing)靶向捕獲(huo)。將(jiang)捕獲(huo)后的(de)(de)(de)文(wen)(wen)庫(ku)混合(he)起來并在Illumina Nextseq 550 測(ce)序儀上進行(xing)(xing)測(ce)序。采用BWA（0.7.15）對(dui)測(ce)序數據進行(xing)(xing)比對(dui)，并用Picard（2.18.9）進行(xing)(xing)覆蓋(gai)深(shen)度(du)和復雜度(du)（評估單一分子數，使用參(can)數為HS文(wen)(wen)庫(ku)大小(xiao)）的(de)(de)(de)計算。

 


圖. IDT xGen cfDNA & FFPE DNA文(wen)(wen)庫(ku)制(zhi)備(bei)試劑盒(he)提高對低(di)頻突變(bian)的(de)(de)檢測(ce)(ce)靈敏(min)度(du)和特異(yi)(yi)性(xing)。使(shi)用25ng的(de)(de)cfDNA標(biao)(biao)準(zhun)品按(an)(an)照IDT提供的(de)(de)標(biao)(biao)準(zhun)流程進(jin)行文(wen)(wen)庫(ku)制(zhi)備(bei)，標(biao)(biao)準(zhun)品中突變(bian)基因的(de)(de)頻率（MAF）為(wei)0.25%。使(shi)用61kb的(de)(de)定制(zhi)IDT xGen Custom Hyb Panels - Production 探針進(jin)行文(wen)(wen)庫(ku)捕獲，在測(ce)(ce)序后(hou)使(shi)用BWA（0.7.15）進(jin)行比(bi)對并按(an)(an)照IDT xGen cfDNA & FFPE試劑盒(he)分析指(zhi)南所述進(jin)行start-stop去(qu)重，或者按(an)(an)照combined read families的(de)(de)方法進(jin)行去(qu)重和錯(cuo)誤校(xiao)正。最后(hou)使(shi)用VarDict（1.5.8）識別(bie)變(bian)異(yi)(yi)。PPV=陽性(xing)預(yu)測(ce)(ce)值，是衡量(liang)突變(bian)檢出準(zhun)確度(du)的(de)(de)指(zhi)標(biao)(biao)。
 

2、IDT xGen Custom Hyb Panels - Production 探針庫

IDT xGen Custom HybPanels - Production 探(tan)針(zhen)是帶有5′端生物素標記(ji)的(de)(de)(de)DNA探(tan)針(zhen)，每一條(tiao)探(tan)針(zhen)均(jun)經(jing)過單獨合成(cheng)、單獨質(zhi)(zhi)檢，可(ke)用(yong)于NGS二(er)代(dai)測序(xu)中對(dui)目標序(xu)列(lie)進行富集。實(shi)驗(yan)證明，與通過微(wei)陣列(lie)合成(cheng)的(de)(de)(de)捕獲(huo)(huo)探(tan)針(zhen)相比，IDT xGen Custom Hyb Panels -Production 探(tan)針(zhen)實(shi)現的(de)(de)(de)捕獲(huo)(huo)均(jun)一性(xing)更(geng)(geng)高，GC偏好性(xing)更(geng)(geng)少(shao)，能夠以(yi)更(geng)(geng)少(shao)的(de)(de)(de)測序(xu)次(ci)數(shu)獲(huo)(huo)得更(geng)(geng)佳的(de)(de)(de)測序(xu)深度。IDT xGen Custom Hyb Panels - Production 探(tan)針(zhen)庫可(ke)用(yong)模(mo)塊化的(de)(de)(de)方式進行制備和使(shi)用(yong)，既可(ke)以(yi)獨立(li)使(shi)用(yong)，也可(ke)以(yi)通過spike-in panel的(de)(de)(de)形式與現有的(de)(de)(de)探(tan)針(zhen)庫結合使(shi)用(yong)，具有非常高的(de)(de)(de)靈活性(xing)，是品質(zhi)(zhi)穩定、性(xing)能優異的(de)(de)(de)捕獲(huo)(huo)探(tan)針(zhen)選擇。


優勢
 
①單獨(du)合成、單獨(du)質控的探針，實現高效均一的目(mu)標富集；

②模塊(kuai)化設計，實現經濟高效的定制和簡單輕松(song)的目(mu)標(biao)靶點擴充；

③嚴(yan)格質(zhi)控，降低批次間差異。

 


圖3.使用IDT的探針(zhen)庫(ku)實現高度(du)均一的目標區域覆蓋(gai)。針(zhen)對(dui)(dui)標準品基因組DNA（Coriell）構(gou)建文(wen)庫(ku)，使用IDT xGen Custom Hyo Panels -Production 探針(zhen)庫(ku)進行(xing)捕(bu)獲反應（目標區域為88kb）。富集后的文(wen)庫(ku)在(zai)Illumina Nextseq測(ce)序(xu)儀進行(xing)測(ce)序(xu)，并對(dui)(dui)600K reads進行(xing)生信分析。結果顯示，（A）單次測(ce)序(xu)的覆蓋(gai)均一度(du)較高；（B）同一個(ge)探針(zhen)庫(ku)的兩個(ge)不同批次，顯示出較高的一致性。


 

三、成功案例

重慶陸軍軍醫大學西南醫院余佩武教授團隊，研(yan)究了(le)基于ctDNA檢測的(de)(de)(de)微小殘留病灶MRD水平(ping)與胃癌術后(hou)(hou)復發風險之(zhi)間的(de)(de)(de)聯系，其研(yan)究成果論(lun)證了(le)ctDNA作為新興的(de)(de)(de)生(sheng)物標志(zhi)物在(zai)胃癌療效檢測和預后(hou)(hou)評估(gu)中的(de)(de)(de)臨(lin)床意義。該研(yan)究中使用(yong)的(de)(de)(de)定(ding)制捕獲panel采購自IDT。



圖(tu)．圖(tu)中顯示了影(ying)像學結果，ctDNA水(shui)平與(yu)腫瘤標志物CEA在(zai)術(shu)后(hou)的(de)動態變化，提示了ctDNA檢測(ce)在(zai)胃癌病(bing)人術(shu)后(hou)檢測(ce)中的(de)潛在(zai)應用價值。

參考文獻
Yang, J., Gong, Y., Lam, V.K. et al. Deep sequencing of circulating tumor DNA detects molecular residual disease and predicts recurrence in gastric cancer. Cell Death Dis 11,346 (2020). //doi.org/10.1038/s41419-020-2531-z


IDT為NGS靶(ba)向捕獲(huo)實驗提供端到端的產(chan)品覆(fu)蓋(gai)，并在精(jing)準(zhun)性(xing)、經濟性(xing)和穩定性(xing)這(zhe)三個方面具有顯著優勢。

①精確性：IDT埃豐富的UMI接頭選擇，結合以IDT xGen cfDNA & FFPE DNA文庫制備試劑盒為代表的新穎的建庫方法，可大大提高樣本轉化率和檢測靈敏度；高質量的探針合成為高效檢測體細胞突變和甲基化水平打下了堅實的基礎，助力ctDNA的多維度研究。

②經濟性：IDT xGen Custom Hyb Panels - Accel 探針庫進一步降低使用門檻，加快探針交付速度，讓新項目快人一步。

③穩定性：超過30年的寡核苷酸合成經驗，結合獨特的化學合成工藝和嚴格的質控方法，使IDT xGen Custom Hyb Panels - Production 探針組的表現穩定。

 

 
四、IDT微小殘留病灶MRD相關產品

 


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——IDT一級代(dai)理商，北京澤平