IDT Alt-R™ CRISPR-Cas9基因編輯系統工具
——crRNA、sgRNA化學定制合成，商品化重組Cas9核酸酶、重組dCas9蛋白
北京澤平代理的進口IDT（Integrated DNA Technologies）Alt-R™ CRISPR-Cas9基因編輯系統，提供免費序列設計工具，提供化學合成CRISPR-Cas9中crRNA（CRISPR-derived RNA）、sgRNA（small guide RNA）的定制合成服務，并生產商品化通用型tracrRNA（trans-activating crRNA）、化膿性鏈球菌S. pyogene來源并由E.coli大腸桿菌表達的高保真或熒光修飾的重組Cas9核酸酶（Cas9 nuclease，限制性內切酶，基因組DNA雙鏈剪切）、重組Cas9切口酶（Cas9 nickase，即缺口酶，對靶鏈、或非靶鏈進行DNA單鏈剪切）、重組dCas9蛋白（無剪切功能，靶點占位蛋白，用于CRISPRi）、以及增強RNP（ribonucleoprotein，核糖核蛋白復合體）電轉染效率的電穿孔增強劑、增強HDR（Homology directed repair，同源重組修復）概率的HDR增強劑、HDR供體DNA的化學合成服務，提供從設計到多重基因組編輯、CRISPR干擾等試劑的工具平臺。
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▲IDT Alt-R CRISPR-Cas9系統（crRNA、tracrRNA、sgRNA、Cas9核酸酶、Cas9切口酶、dCas9蛋白、電穿孔增強劑、HDR增強劑、HDR DNA供體）
▲IDT Alt-R CRISPR-Cas12a/Cpf1系統
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IDT Alt-R™ CRISPR-Cas9概述
IDT的Alt-R™ CRISPR-Cas9系統，分別對crRNA、tracrRNA、sgRNA序列進行優化縮短、化學修飾，對化膿性鏈球菌S. pyogene Cas9內切酶結構域進行突變，獲得了高精確性的單鏈、雙鏈剪切功能，再通過電穿孔（如Lonza Nucleofector核轉染系統）轉染RNP，可進行精確地基因編輯操作。
傳統構建CRISPR-Cas9質粒的方法，質粒大小高達6-10kb，很難轉染，而如使用原代細胞等難轉染的細胞，轉染效率更低。且質粒不斷產生CRISPR-Cas9，使脫靶率顯著增加。IDT轉染RNP蛋白復合體的方法，通過優化CRISPR-Cas9組件，在提升剪切精確性的基礎上，提高轉染效率、減少細胞毒性、降低脫靶率，進(jin)而(er)提高了基因編輯效率。
IDT Alt-R™ CRISPR-Cas9產品
1、Cas9核酸酶
Alt-R™ Cas9核(he)酸酶(mei)，S. pyogene來源Cas9，大腸(chang)桿菌表達純化，添加NLS（Nuclear localization sequence，NLS）和C端6-His標簽。以10μg/μL的溶液(ye)提供。100μg Cas9核(he)酸酶(mei)=610pmol。
| 貨號 |
產品名稱 |
規格 |
備注 |
| 1081058 |
Alt-R™ S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 µg |
100 µg |
野生型，10 µg/µL，100 µg = 610 pmol. |
| 1081059 |
Alt-R™ S.p. Cas9 Nuclease V3, 500 µg |
500 µg |
| 10000735 |
Alt-R™ S.p. Cas9 Nuclease V3, 5 mg |
5 mg |
Alt-R™ HiFi Cas9高保真(zhen)核酸酶，經序列優化，顯著提高中靶率，是常(chang)規實驗的更佳(jia)選擇(ze)，非(fei)常(chang)適(shi)合(he)棘手(shou)的基因組編輯應用。
| 貨號(hao) |
產(chan)品名稱 |
規格 |
備注 |
| 1081060 |
Alt-R™ S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg |
100 µg |
高(gao)保真，10 µg/µL，100 µg = 610 pmol |
| 1081061 |
Alt-R™ S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 500 µg |
500 µg |
| 10007803 |
Alt-R™ S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 5 mg |
5 mg |
Alt-R™ Cas9-GFP核(he)酸(suan)酶、Alt-R™ Cas9-RFP核(he)酸(suan)酶，具有NLS和C端6-His標(biao)簽(qian)。添加(jia)GFP綠色(se)熒(ying)光、或(huo)RFP紅色(se)熒(ying)光修飾，專為(wei)需要蛋白質(zhi)轉染(ran)后(hou)可視化、或(huo)使(shi)用熒(ying)光激活(huo)細(xi)胞分選 (FACS) 富集編輯細(xi)胞的應用設計。
| 貨號 |
產品名稱 |
規格(ge) |
備注(zhu) |
| 10008100 |
Alt-R™ S.p.Cas9-GFP V3, 100 µg |
100 µg |
GFP標簽，10 µg/µL，100 µg = 530 pmol. |
| 10008161 |
Alt-R™ S.p.Cas9-GFP V3, 500 µg |
500 µg |
| 10008162 |
Alt-R™ S.p.Cas9-RFP V3, 100 µg |
100 µg |
RFP標簽，10 µg/µL，100 µg = 530 pmol. |
| 10008163 |
Alt-R™ S.p.Cas9-RFP V3, 500 µg |
500 µg |
Alt-R™ Cas9核酸酶（不含甘油），具有NLS和C端6-His標簽。以10µg/µL的無甘油溶液形式提供。
| 貨(huo)號(hao) |
產品名稱 |
規(gui)格 |
備注 |
| 10007806 |
Alt-R™ S.p.Cas9 V3, glycerol-free, 100µg |
100 µg |
無甘油(you)，10 µg/µL，100 µg = 610 pmol |
| 10007807 |
Alt-R™ S.p.Cas9 V3, glycerol-free, 500µg |
500 µg |
| 10007808 |
Alt-R™ S.p.Cas9 V3, glycerol-free, 5mg |
5 mg |
2、Cas9切口酶
Alt-R™ Cas9切(qie)(qie)(qie)口酶(mei)/缺(que)口酶(mei)，S. pyogene來源(yuan)Cas9，大(da)腸桿菌表達純化，添加NLS和(he)C端6-His標簽。其中Alt-R™ Cas9 D10A切(qie)(qie)(qie)口酶(mei)中RuvC-like內切(qie)(qie)(qie)酶(mei)結構域功能失活，對(dui)DNA靶(ba)向鏈進行單鏈切(qie)(qie)(qie)割(ge)。Alt-R™ Cas9 H840A切(qie)(qie)(qie)口酶(mei)，HNH結構域失活，對(dui)非靶(ba)向鏈單鏈切(qie)(qie)(qie)割(ge)。以10μg/μL的溶液提(ti)供。100μg Cas9切(qie)(qie)(qie)口酶(mei)=610pmol。
| 貨號 |
產品名稱(cheng) |
規格 |
備注 |
| 1081062 |
Alt-R™ S.p. Cas9 D10A Nickase V3, 100 µg |
100 µg |
缺口酶，切(qie)割靶向(xiang)鏈（不包含PAM的鏈） |
| 1081063 |
Alt-R™ S.p. Cas9 D10A Nickase V3, 500 µg |
500 µg |
| 1081064 |
Alt-R™ S.p. Cas9 H840A Nickase V3, 100 µg |
100 µg |
缺口酶，切割非靶向鏈(lian)（包含PAM的(de)鏈(lian)） |
| 1081065 |
Alt-R™ S.p. Cas9 H840A Nickase V3, 500 µg |
500 µg |
3、dCas9蛋白
Alt-R™ dCas9占(zhan)位蛋白，S. pyogene來(lai)源Cas9，大腸(chang)桿菌(jun)表達(da)純化(hua)，喪失內切酶(mei)功能(neng)，添加NLS和(he)C端6-His標簽(qian)。dCas9蛋白可用于(yu)CRISPRi，進(jin)行基因下(xia)調（knockdown）等(deng)，相比RNAi，由于(yu)CRISPRi需要在轉錄起始位點附近(jin)才能(neng)發揮功能(neng)，其脫靶率遠(yuan)低于(yu)RNAi。Alt-R™ dCas9蛋白，以10μg/μL的溶液提供(gong)。100μg dCas9蛋白=610pmol。
| 貨號 |
產(chan)品(pin)名(ming)稱 |
規格 |
備(bei)注(zhu) |
| 1081066 |
Alt-R™ S.p. dCas9 Protein V3, 100 µg |
100 µg |
無切割活(huo)性 |
| 1081067 |
Alt-R™ S.p. dCas9 Protein V3,500 µg |
500 µg |
4、crRNA（定制）
Alt-R™ crRNA，由(you)19-20nt特異性序列(lie)（定制(zhi)）和16nt通用序列(lie)融合(he)形(xing)成(cheng)，相比野生(sheng)型(xing)，序列(lie)更短(duan)，中靶(ba)率更高。經化學(xue)修飾防止被細胞核(he)糖核(he)酸酶降解(jie)，必須與tracrRNA一(yi)起使用以(yi)形(xing)成(cheng)gRNA。
Alt-R™ crRNA XT，相比(bi)Alt-R™ crRNA，經其他化(hua)學修飾，用(yong)于高核酸酶條件或帶有Cas9 mRNA的實驗，可提(ti)高基因編輯的穩定性(xing)。必須與(yu)tracrRNA一起使用(yong)。
| 貨號 |
產品名稱 |
規(gui)格 |
備(bei)注 |
| 定制 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol |
2 nmol |
36nt，帶Alt-R修飾，與tracrRNA結合使用 |
| 定制 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA, 10 nmol |
10 nmol |
| 定制 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA, 50 nmol |
50 nmol |
| 定(ding)制 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA, 100 nmol |
100 nmol |
| 定(ding)制(zhi) |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA XT, 2 nmol |
2 nmol |
36nt，比crRNA多(duo)了額外化學(xue)修飾(shi)，更穩定(ding) |
| 定制(zhi) |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA XT, 10 nmol |
10 nmol |
5、sgRNA（定制）
Alt-R™ sgRNA，由(you)crRNA和(he)(he)tracrRNA序(xu)列(lie)(lie)融合組(zu)成的(de)單個RNA，含(han)有(you)19-20nt的(de)特異(yi)性(xing)序(xu)列(lie)(lie)（定(ding)制）和(he)(he)80nt通用序(xu)列(lie)(lie)，經(jing)化學修飾，穩定(ding)性(xing)更高(gao)，用于高(gao)核酸酶條(tiao)件(jian)或帶有(you)Cas9 mRNA的(de)實驗(yan)。相比體外轉錄(lu)的(de)sgRNA，減少(shao)細(xi)胞免疫反(fan)應(ying)，更小細(xi)胞毒性(xing)。
| 貨號 |
產(chan)品(pin)名稱 |
規格(ge) |
備注 |
| 定制 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 sgRNA, 2 nmol |
2 nmol |
100nt，兩(liang)端有(you)2’OMe 堿基和硫(liu)代(dai)磷酸酯PS修飾 |
| 定(ding)制(zhi) |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 sgRNA, 10 nmol |
10 nmol |
| 定(ding)制(zhi) |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 sgRNA, 50 nmol |
50 nmol |
| 定制 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 sgRNA, 100 nmol |
100nmol |
6、tracrRNA
Alt-R™ tracrRNA，通用67nt序列，遠遠短于野(ye)生型的89nt，縮短后性(xing)能提高，經(jing)化學修飾，具有(you)核酸酶抗性(xing)。可提供(gong)熒光標記(ji)，測定(ding)轉染效率。必(bi)須與crRNA一起使用以形成gRNA。
| 貨號(hao) |
產品名稱 |
規格 |
備注 |
| 1072532 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 tracrRNA, 5 nmol |
5 nmol |
67nt，與(yu)crRNA結合使用 |
| 1072533 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol |
20 nmol |
| 1072534 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 tracrRNA, 100 nmol |
100 nmol |
| 1075927 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 tracrRNA, ATTO™ 550, 5 nmol |
5 nmol |
67nt，帶(dai)ATTO熒光 |
| 1075928 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 tracrRNA, ATTO™ 550, 20 nmol |
20 nmol |
圖.穩定表達Cas9蛋白的HEK-293細胞，轉染(ran)Alt-R™ crRNA(未標記):tracrRNA(標記)，轉染(ran)后48小(xiao)時，熒光(guang)顯微鏡下10倍放大。
7、電穿孔增強劑
Alt-R™ Cas9電穿(chuan)孔(kong)Enhancer，是Cas9特異(yi)性的載體DNA，當(dang)使用原代細胞或難(nan)轉染細胞時，可提高Lonza(原Amaxa）Nucleofector核(he)轉染系統等電穿(chuan)孔(kong)設備對RNP的轉染效率(lv)(lv)，進(jin)而提高基因編輯效率(lv)(lv)。
| 貨號 |
產品名(ming)稱 |
規格 |
備注(zhu) |
| 1075915 |
Alt-R™ Cas9 Electroporation Enhancer, 2 nmol |
2 nmol |
電(dian)穿孔增(zeng)強劑，增(zeng)強轉染(ran)效率 |
| 1075916 |
Alt-R™ Cas9 Electroporation Enhancer, 10 nmol |
10 nmol |
| 10007805 |
Alt-R™ Cas9 Elec Enhancer, 100 nmol |
100 nmol |
8、HDR增強劑
Alt-R™ HDR Enhancer，小分子化合(he)物，可(ke)提(ti)高(gao)同(tong)源(yuan)重(zhong)組修復概率。在包括貼壁、懸(xuan)浮的大量(liang)細(xi)胞系中(zhong)均有活性，可(ke)用于Cas9核酸酶、Cas12a（Cpf1）核酸酶。
| 貨號 |
產(chan)品名稱 |
規格 |
備注 |
| 10007910 |
Alt-R™ HDR Enhancer V2, 30 µL |
30 µL |
HDR增強(qiang)劑，增加同源重組修復(fu)傾向性 |
| 10007921 |
Alt-R™ HDR Enhancer V2, 150 µL |
150 µL |
| 1081072 |
Alt-R™ HDR Enhancer, 100 µL |
100 µL |
| 1081073 |
Alt-R™ HDR Enhancer, 500 µL |
500 µL |
9、供體DNA（定制）
Alt-R™ HDR供體寡核苷(gan)(gan)酸，專門(men)為同(tong)(tong)源重組(zu)修復基因敲(qiao)入開發，具有比標準寡核苷(gan)(gan)酸更高的穩定性和更高的摻入率，可同(tong)(tong)時用于Cas9核酸酶和Cas9切口酶。
| 貨號 |
產品名稱 |
規格 |
備注 |
| 定制 |
Alt-R HDR Donor Oligo, 2 nmol |
2 nmol |
45-200nt，Alt-R修飾和硫代磷(lin)酸酯PS修飾 |
| 定制(zhi) |
Alt-R HDR Donor Oligo, 10 nmol |
10 nmol |
| 定(ding)制(zhi) |
Alt-R™ HDR Donor Block, 201-500 bp, 3 µg |
3 µg |
非常適合(he)進行段(duan)基因組(zu)的修(xiu)改和插(cha)入；帶修(xiu)飾雙鏈DNA |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 201-500 bp, 10 µg |
10 µg |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 501-2000 bp, 3 µg |
3 µg |
| 定制(zhi) |
Alt-R™ HDR Donor Block, 501-2000 bp, 10 µg |
10 µg |
| 定(ding)制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 2001-3000 bp, 3 µg |
3 µg |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 2001-3000 bp, 10 µg |
10 µg |
IDT Alt-R™ CRISPR-Cas9實驗流程
【方法一】
1、（使用IDT序列設計工具）設計Alt-R™ crRNA，使其間隔區（Spacer）序列與DNA靶序列互補，提交給IDT定制合成crRNA；
2、將Alt-R™ crRNA與Alt-R™ tracrRNA混合，通過crRNA的重復序列區（Repeats）與tracrRNA堿基配對, 形成向導RNA（guide RNA，簡稱gRNA）；
3、將gRNA與Alt-R™ Cas9蛋白混勻，形成核糖核蛋白體（ribonucleoprotein，簡稱RNP)；
4、將RNP通過電轉染等導入細胞或細胞核；
5、通過crRNA的Spacer識別DNA靶序列，通過Cas9蛋白識別PAM序列（前間區序列鄰近基序，protospacer adjacent motif，簡稱PAM），對DNA進行剪切；
6、對DNA斷裂處進行修復
①進行非同源末端連接修復(Non-homologous end-joining，簡稱NHEJ），實現基因敲除（knockout）；
②（使用IDT序列設計工具）設計供體DNA模板，進行同源重組修復（Homology directed repair，簡稱HDR），實現基因敲入（knockoin）、基因敲除、基因沉默等。
【方(fang)法二】
1、（用IDT工具）設計sgRNA，使其Spacer與DNA靶序列互補，提交給IDT定制合成sgRNA；
2、將sgRNA與Cas9蛋白混勻，形成RNP；
3、將RNP通過電轉染等導入細胞或細胞核；
4、通過sgRNA的Spacer識別DNA靶序列，通過Cas9蛋白識別PAM序列，對DNA進行剪切；
5、對DNA斷裂處進行修復
①進行非同源末端連接修復，實現基因敲除；
②（用IDT工具）設計供體DNA模板，進行同源重組修復，實現基因敲入、敲除、沉默等。
IDT Alt-R™ crRNA序列設計示(shi)意圖(tu)
Alt-R™ CRISPR-Cas9優勢
1、特別優化的crRNA/tracrRNA/sgRNA長度，提高基因編輯性能
以HPRT基因中的12個位點為靶點，分(fen)別使(shi)用Alt-R™ crRNA:tracrRNA、Alt-R™ crRNA XT:tracrRNA、Alt-R™ sgRNA，與Alt-R™ Cas9核(he)酸酶組裝成3種RNP，加入2μM Alt-R™ Cas9電穿(chuan)孔Enhancer，轉(zhuan)染(ran)HEK-293細胞(bao)，培(pei)養48小(xiao)時后，通過二代(dai)測序檢測總(zong)的實驗效率，結(jie)果顯(xian)示(shi)其具有很好的穩定性。
2、化學修飾RNA，增加核酸酶抗性，減少免疫應答和細胞毒性
以HPRT1的12個位點為靶點，分別用Alt-R™ crRNA:tracrRNA、體外轉錄（IVT）RNA，轉染可高效表達化膿性鏈球菌Cas9蛋白的HEK-293細胞，24小時后，測定常見應激反應基因IFIT1（A）和OAS2（B）的表達水平。（A）qPCR顯示IVT RNA強烈誘導IFIT1，而Alt-R™ RNA無影響。（B）qPCR顯示IVT RNA對OAS2的誘導可測，而Alt-R™ RNA處于基線。同時IFITM1、RIGI、OAS1等3個應激反應相關基因均得到相似結果，說明Alt-R™ RNA不會激活細胞先天免疫反應。
3、優化的(de)Cas9蛋(dan)白(bai)(bai)和高保真(zhen)HiFi Cas9蛋(dan)白(bai)(bai)，提(ti)供更高的(de)特異性切割
4、電穿孔增強劑，提高轉染效率，尤其是原代細胞等較難轉染的細胞
用0.125μM-4μM RNP（Alt-R™ crRNA:tracrRNA:Cas9復合體），通過Lonza Nucleofector 核轉染K562細胞（A）、Jurkat細胞（B）、HEK-293細胞（C）時，使用電穿孔Enhancer（深藍色）、不使用（淺藍色）的效率。
5、HDR增強劑，提高同源重組修復效率
①提高多種細胞HDR
以人HPRT為靶點，使用Lonza Nucleofector核轉染系統，將4μM RNP（由Alt-R™ crRNA、Alt-R™ tracrRNA、Alt-R™ Cas9組裝），加入4μM Alt-R™ Cas9電穿孔Enhancer，以3μM IDT Ultramer寡核苷酸作為同源重組修復DNA模板，轉染人多種細胞系。電轉后，細胞培養在含30μM Alt-R™ HDR Enhancer的培養基中（綠色），或培養在含有DMSO的培養基中作為陰性對照（棕色），HEK-293、HeLa培養48小時，Jurkat、K562培養72小時，通過限制性片段長度多態性（RFLP）、靶序列PCR進行HDR分析，顯示Alt-R™ HDR Enhancer可提高多種細胞類型的同源重組修復效率。
②提高多種基因HDR
以人基因組多個位點為靶點，將4μM Alt-R™ Cas9 RNP，加入4μM Alt-R™ Cas9電穿孔Enhancer、3μM IDT Ultramer單鏈DNA模板，通過電穿孔轉染。電轉后，細胞分別培養在含30μM Alt-R™ HDR Enhancer的培養基（藍色）、含有DMSO的培養基（綠色）、未處理的培養基（棕色），48-72小時后，通過RFLP、PCR進行HDR分析，顯示Alt-R™ HDR Enhancer可提高不同基因的HDR效率。
6、在線CRISPR序列設計工(gong)具，方(fang)便地設計高質量的crRNA/sgRNA/同源(yuan)重組(zu)修復DNA模板(ban)/引物(wu)等
如(ru)物(wu)種(zhong)的基因組富含A、T，或Alt-R™ CRISPR-Cas9的位點(dian)不適合(he)，IDT同時提供CRISPR-Cas12a系統，盡(jin)可能滿(man)足實驗需求。
Cas9和Cas12a系統區別和應用
| IDT Alt-R™ CRISPR |
Alt-R™ CRISPR-Cas9系統 |
Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）系統 |
| Alt-R™ Cas9核酸酶 |
Alt-R™ HiFi Cas9高保真核酸酶 |
Alt-R™ Cas9 D10A切口酶 |
Alt-R™ Cas9 H840A切口酶 |
Alt-R™ dCas9蛋白 |
Alt-R™ Cas12a核酸酶 |
| 特點 |
通用Cas9酶，易于使用且經濟(ji)實惠 |
經序列優化的(de)Cas9酶(mei)，提(ti)高中靶率(lv)，降低脫靶率(lv)，高性價比 |
突變的(de)Cas9酶，在RuvC-like結(jie)構域中發生(sheng)突變，使其缺失在非靶向鏈的(de)切割能力 |
突變(bian)的(de)Cas9酶，在HNH結構域中發生突變(bian)，使其缺失在靶向鏈的(de)切割能力(li) |
突(tu)變的(de)Cas9酶(mei)，僅結(jie)合靶(ba)向DNA，缺失核酸酶(mei)切割能(neng)力 |
通(tong)用Cas12a酶，富含(han)AT的物種，或使用CRISPR-Cas9有限制(zhi) |
| PAM識別 |
NGG |
TTTV或(huo)TTTN |
| DNA切割 |
雙鏈 |
雙鏈 |
靶向鏈 |
非靶向鏈(lian) |
\ |
雙鏈 |
| 末端 |
平末端 |
5’突出 |
3’突出 |
\ |
5’突出 |
| 建議用途 |
一般基因(yin)編輯實驗 |
滿足大多數CRISPR基因(yin)編輯需求，兼顧效率(lv)和成(cheng)本(ben) |
適(shi)用(yong)于同時使用(yong)2種(zhong)crRNA，各自(zi)識別并切割(ge)2條鏈中(zhong)一條，通(tong)過將spacer由(you)20nt提(ti)高(gao)到(dao)40nt，實現更高(gao)特異性 |
基(ji)因沉默(mo)，CRISPR干擾(rao)CRISPRi |
無(wu)法使用(yong)Cas9的基因編輯(ji)實驗 |
| 規格 |
100 μg或500 μg |
| Cas9+gRNA |
crRNA |
19-20nt特異(yi)性(xing)序(xu)列（推薦(jian)使用20nt），16nt通用序(xu)列 |
\ |
| tracrRNA |
67nt通用序列(lie) |
\ |
| Cas9+sgRNA |
sgRNA |
19-20nt特異性序(xu)(xu)列（推薦使用20nt），80nt通用序(xu)(xu)列，經過序(xu)(xu)列修(xiu)飾，不會引(yin)起細胞(bao)免疫反應，不會激活無關的基因 |
\ |
| Cas12a+crRNA |
crRNA |
\ |
20-24nt特(te)異性序列(lie)(lie)（推薦使用21nt），20nt通(tong)用序列(lie)(lie) |
注：
N=任意堿基
V=A、C、G
參考(kao)文獻(xian)
1. Large-scale GMP-compliant CRISPR-Cas9–mediated deletion of the glucocorticoid receptor in multivirus-specific T cells. Rafet Basar,et al.，Blood Advances (2020) 4 (14): 3357–3367
2. Partner independent fusion gene detection by multiplexed CRISPR-Cas9 enrichment and long read nanopore sequencing.Christina Stangl,et al.,Nature Communications volume 11, Article number: 2861 (2020)
3. sgRNA Sequence Motifs Blocking Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Robin Graf,et al.,Cell Reports,Volume 26, Issue 5, 29 January 2019, Pages 1098-1103.e3
4. Rapid in vitro production of single-stranded DNA. Dionis Minev,et al.，Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue 22, 16 December 2019, Pages 11956–11962
5. Neuron-Specific Genome Modification in the Adult Rat Brain Using CRISPR-Cas9 Transgenic Rats.Susanne Bäck,et al.,Neuron,Volume 102, Issue 1, 3 April 2019, Pages 105-119.e8
6. Highly Efficient Transgenesis in Ferrets Using CRISPR/Cas9-Mediated Homology-Independent Insertion at the ROSA26 Locus.Miao Yu,et al.,Scientific Reports volume 9, Article number: 1971 (2019)
7. RNA‐guided endonuclease – in situ labelling (RGEN‐ISL): a fast CRISPR/Cas9‐based method to label genomic sequences in various species.Takayoshi Ishii,et al., New Phytol. 2019 May; 222(3): 1652–1661.
8. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Christopher A. Vakulskas,et al.,Naturemedicine,Published: 06 August 2018
9. Increasing Cas9-mediated homology-directed repair efficiency through covalent tethering of DNA repair template. Eric J. Aird,et al.,Communications biology, Published: 31 May 2018
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